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精子细胞毒试验

2009-11-15 08:57:0039健康网社区

  抗精子抗体与精子结合后,在补体参与下,可导致精子制动和死亡,利用台盼蓝或伊红Y 等染料使死精子染色,间接验证血清或分泌液中是否有制动精子的抗体存在。

  (一)台盼蓝染色法

  【准备】

  (1)待检血清的分离和灭活补体。

  (2)AB 血型人血清(补体)制备。

  (3)2% 台盼蓝液配制(用蒸馏水)。

  (4)台盼蓝-生理盐水溶液配制:取适量生理盐水,加等体积 2% 台盼蓝水溶液,混匀即可。

  (5)配制 0.01 mol/L,pH 7.4 PBS 溶液。

  【方法】

  (1)取正常新鲜精液[精子浓度为(40~ 100)× 106/mL]用 pH 7.4 PBS作 1∶10 稀释,以500r/min 30min离心洗涤一次,弃去上清,沉渣用 PBS调整精子浓度为 100× 106/mL 的精子悬液。

  (2)在小试管内加入 1滴待检血清,1滴精子悬液和 2滴补体血清。置 37℃ 孵育,并于30min、60min分别追加 2滴补体血清,直至 90min后加入 1滴台盼蓝生理盐水溶液,继续孵育 60min,取出小试管,以 500 r/min,30min离心,弃去上清,将沉渣涂片,待干燥后镜下观察。以阴性血清作对照组,以同样条件和方法处理。

  (3)计数:对照组:记录数至 100个无染色精子(活精子)时所需的总精子数(含 100个无染色精子加一定数量染色的死精子)。实验组:记录对照组相应的总精子数,把其中所含的无染色精子(活精子)数作 X。将 100- X 所得的数目,即为被检血致死的精子数,这个数目称为精子毒性指数(STI)。

  【判断】

  (1)STI>25时,P≤0.01,判为阳性。

  (2)STI在 15~ 20之间,判为可疑。

  (3)STI<15时,判为阴性。

  本法所得阳性率与精子制动试验的阳性率较为一致。

  (二)伊红 Y 染色法

  【准备】

  (1)用蒸馏水配制 4% 伊红 Y 染液。

  (2)配制 0.01mol/L,pH 7.4 PBS溶液。

  【方法】

  (1)取正常新鲜精液(精子浓度宜大于:60×106/mL),用 pH 7.4 的 PBS洗涤 3次,调整精子浓度为 10×107/mL。

  (2)取精子悬液 16μL,移置载玻板的漆孔内,分别设 2个测定和对照孔,另取待检血清20μL,补体血清 4μL 加入测定孔内,对照孔只加待测血清不加补体,充分混匀。

  (3)把玻板移入湿盒内,在 37℃ 孵育 30min,每孔加 4% 伊红 Y 4μL,加上盖玻片使其作用 2min,进行镜检。

  【判断】

  由于活精子不着色,死精子着染为红色,计算 200个精子中,死精子所占的百分数,减去对照组死精子的百分数,即为抗体杀灭精子的百分率。以杀灭精子≥10% 以上者为阳性。

(实习编辑:黄秀杰)

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